組織研磨儀

1.CTAB抽提液：

2%（w/v）CTAB

100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

20 mmol/L EDTA(pH8.0)

1.4 mol/L NaCl

抽提含多酚較多的植物材料時（比如木本植物），上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

抽提液于室溫保存，可在幾年內保持穩定。臨用之前向裝有上述抽提液的試管中加入約2%-3%（v/v）的β-巰基乙醇。

2、醋酸鈉：

3 mol/L NaAc

用冰乙酸調pH值至4.8-5.2。

3、TE溶液：

4、其它：

無水乙醇，異丙醇，75％乙醇，酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），氯仿：異戊醇（24：1），β-巰基乙醇，重蒸水。

二、 實驗步驟

1. 樣品研磨

1) 取1g的樣品放入2ml ep管中

2) 加入1-2粒5mm研磨珠

3) 加入1ml的CTAB 抽提液

4) 將加有樣品的ep管放入高通量組織研磨儀的適配器中，蓋好

5) 將研磨轉速調到1800，設定研磨時間為90秒（可根椐樣品的研磨的難易程度來調節，此數據是以銀杏落葉為樣本得出）

6) 啟動研磨儀對樣品進行研磨（根據不同的樣品，本身性質不同，需要對研磨頻率和研磨時間進行適當的調整）

2. DNA的粗提

1) 將研磨好的樣品取出于65℃水浴45min，中途間隔（輕柔）振蕩三次混勻

2) 冷卻后加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕柔顛倒混勻使乳化10min

3) 7000g-8000g離心10min（18-20℃）

4) 吸取上清于另一干凈的離心管中

5) （根據需要可用氯仿：異戊醇如上法重復抽提一次，吸取上清）

6) 加入與上清液等體積（且已于-20℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，約1至2分鐘后應有白色絮狀沉淀出現（若沒有，則加入上清液1/5至1/10體積的pH4.8-5.2的3M NaAc,混勻，于－20℃冰箱中沉淀30min）

7) 離心法沉淀DNA

8) 在75%乙醇中漂洗DNA數分鐘以上，用Tip頭吸干乙醇

9) 用1ml 75%乙醇再漂洗一次

10) 沉淀于室溫或64℃以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現半透明，不要過度干燥

11) 用50μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。

3. DNA的純化

1) 向TE溶解的DNA粗提物中入4-10μl RNaseA(約40-100μg)

2) 于37℃酶解RNA 1hr或65℃酶解RNA 30min以上

3) 加入50μl酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），輕輕顛倒混勻10min

4) 10000g以上常溫離心10min，吸取上清

5) 加入50μl仿氯：異戊醇（24：1）輕輕顛倒10min

6) 10000g以上常溫離心10min，吸取上清 (根據需要可重復用氯仿：異戊醇如上法再抽提1-2次，以充分去除蛋白和酚)

7) 向上清中加入1/5-1/10體積的pH4.8-5.2的3M NaAc,并加入2.5倍體積無水乙醇，于－20℃沉淀30min以上

8) 12000g、4℃低溫離心10min,吸干液體

9) 沉淀用75％乙醇漂洗二次

10) 沉淀于室溫或64℃以下恒溫箱中干燥片刻至剛開始出現半透明狀，勿過度干燥加入50μl重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶

11) 取5μl DNA電泳檢查DNA的質量

12) 100-500倍稀釋后于分光光度計上測定OD260及OD280，分析DNA的濃度和質量

13) 保存DNA于-20℃

補充：如果需要提取的樣品比較多（比如1g），研磨好的樣品在后續的提取中，需要轉移到大的epp管中，研磨時可以加入較少的抽提液，研磨完畢按照1g樣品10ml提取液補充抽提液，進行后續的操作。